Downstream Processing (DSP) Nedir?

Downstream Processing (DSP), biyoteknolojik üretimde hücre kültüründen elde edilen ham ürünün saflaştırılarak final formuna dönüştürülmesi sürecidir. Biyolojik ilaçların (monoklonal antikorlar, rekombinant proteinler, aşılar) üretiminde kritik bir aşamadır.

Upstream vs Downstream:

Upstream Processing (USP): Hücre hattı geliştirme, fermentasyon, hücre çoğaltma
Downstream Processing (DSP): Saflaştırma, formülasyon, dolum

DSP Neden Önemli?

Faktör	DSP Önemi
Maliyet	Toplam üretim maliyetinin %50-80'i
Kalite	Saflık, güvenlik, stabilite
Verim	Kayıpların minimize edilmesi
Düzenleyici	FDA/EMA onay gereksinimleri

Bir monoklonal antikor üretiminde:

Fermentasyon verimi: ~5 g/L
DSP sonrası verim: ~3-4 g/L (kayıp kaçınılmaz)
Hedef saflık: >99%
Toplam süre: DSP ~%70

DSP İş Akışı

Hücre Kültürü (USP)
        │
        ▼
┌───────────────────┐
│   HASAT (Harvest) │ ─── Hücrelerin ayrılması
└───────────────────┘
        │
        ▼
┌───────────────────┐
│    YAKALAMA       │ ─── Hedef proteinin yakalanması
│    (Capture)      │     (Protein A, IEX)
└───────────────────┘
        │
        ▼
┌───────────────────┐
│   ARA SAFLAŞTIRMA │ ─── Safsızlıkların uzaklaştırılması
│   (Intermediate)  │     (IEX, HIC)
└───────────────────┘
        │
        ▼
┌───────────────────┐
│    PARLATMA       │ ─── Final saflaştırma
│    (Polishing)    │     (SEC, UF/DF)
└───────────────────┘
        │
        ▼
┌───────────────────┐
│   FORMÜLASYON     │ ─── Stabilizasyon, dolum
└───────────────────┘
        │
        ▼
     Final Ürün

DSP Adımları Detaylı

1. Hücre Hasadı (Harvest/Clarification)

Hücrelerin ve hücre kalıntılarının üründen ayrılması.

Yöntemler:

Yöntem	Prensip	Uygulama
Santrifüj	Yoğunluk farkı	Büyük hacimler
Depth filtrasyon	Mekanik tutma	Ön berraklaştırma
Mikrofiltrasyon (MF)	0.1-0.45 µm membran	Hücre uzaklaştırma
Flokülasyon	Kimyasal çöktürme	Yüksek hücre yoğunluğu

Çıktı: Berrak süpernatant (Cell-Free Harvest)

2. Yakalama (Capture)

Hedef proteinin seçici olarak bağlanması. DSP'nin en kritik adımı.

Monoklonal Antikorlar için:

Protein A Afinite Kromatografisi

Verim: >95%
Saflık: >95% (tek adımda)
Kapasite: 30-50 g IgG / L resin

Yükleme → Yıkama → Elüsyon (düşük pH) → Nötralizasyon

Alternatifler:

İyon değişim (IEX) - ekonomik
Mixed-mode kromatografi
Protein L (Fab fragmentleri için)

3. Viral İnaktivasyon

Biyogüvenlik için zorunlu adım.

Yöntem	Mekanizma	Koşullar
Düşük pH	Zarflı virüsler	pH 3.5-3.7, 30-60 dk
Solvent/Deterjan	Zarflı virüsler	%1 Tri-n-butyl phosphate + %1 Triton X-100
Nanofiltrasyon	Boyut bazlı	15-20 nm filtre
UVC	DNA hasarı	254 nm ışınlama

Not: Genellikle 2 ortogonal yöntem kullanılır (düşük pH + nanofiltrasyon).

4. Ara Saflaştırma (Intermediate Purification)

Kalan safsızlıkların uzaklaştırılması.

Uzaklaştırılacak safsızlıklar:

Host Cell Protein (HCP)
Host Cell DNA
Sızıntı yapan Protein A (Leached Protein A)
Agregalar
Endotoksin

Yaygın teknikler:

Teknik	Hedef Safsızlık
Anyon değişim (AEX)	DNA, HCP, endotoksin (negatif yüklü)
Katyon değişim (CEX)	Agregalar, HCP varyantları
HIC	Hidrofobik safsızlıklar
Mixed-mode	Çoklu mekanizma

5. Parlatma (Polishing)

Final kalite parametrelerinin sağlanması.

Size Exclusion Chromatography (SEC):

Agregat uzaklaştırma
Tampon değişimi
MW doğrulama

Ultrafiltrasyon/Diafiltrasyon (UF/DF):

Konsantrasyon
Tampon değişimi (formülasyon tamponu)
Final konsantrasyon ayarı

6. Formülasyon ve Dolum

Ürünün stabil formuna dönüştürülmesi.

Formülasyon bileşenleri:

Tampon (pH stabilizasyonu)
Stabilizatörler (sukroz, trehaloz)
Surfaktan (polisorbat 80)
Antioksidan (gerekirse)

Dolum:

Aseptik dolum (Grade A ortam)
Vial, şırınga veya kartuş
Liyofilizasyon (gerekirse)

DSP Uzmanı Nasıl Olunur?

Eğitim Gereksinimleri

Lisans (zorunlu):

Biyomühendislik
Kimya Mühendisliği
Biyoteknoloji
Kimya / Biyokimya

Tercih edilen:

Yüksek lisans (Biyoproses, Biyoteknoloji)
Sektör deneyimi (staj, part-time)

Aranan Yetkinlikler

Teknik beceriler:

FPLC/ÄKTA operasyonu
Kromatografi teknikleri (IEX, HIC, SEC, Afinite)
UF/DF sistemleri
Analitik yöntemler (SDS-PAGE, SEC-HPLC, ELISA)
GMP dokümantasyon
Ölçeklendirme prensipleri

Kişisel özellikler:

Problem çözme
Detaylara dikkat
Ekip çalışması
Baskı altında çalışabilme

Kariyer Yolu

DSP Teknisyeni (0-2 yıl)
        │
        ▼
DSP Uzmanı / Scientist (2-5 yıl)
        │
        ▼
Kıdemli DSP Uzmanı (5-8 yıl)
        │
        ▼
DSP Grup Lideri / Supervisor (8-12 yıl)
        │
        ▼
DSP Müdürü / Director (12+ yıl)

Çalışma Alanları

Biyoteknoloji şirketleri: Antikor, protein üretimi
İlaç şirketleri: Biyolojik ilaç üretimi
CDMO'lar: Kontrat üretim
Akademi: Araştırma, eğitim
Ekipman firmaları: Uygulama uzmanı

DSP Proses Geliştirme

Design of Experiments (DoE)

Proses parametrelerinin sistematik optimizasyonu.

Optimize edilecek parametreler:

pH, kondüktivite
Akış hızı
Yükleme kapasitesi
Gradient profili
Sıcaklık

Quality by Design (QbD)

ICH Q8/Q9/Q10 prensiplerine uygun geliştirme.

Kritik Kalite Atributları (CQA):

Saflık (>99%)
Agregasyon (<1%)
HCP (<100 ppm)
DNA (<10 pg/mg)
Endotoksin (<0.5 EU/mg)

Kritik Proses Parametreleri (CPP):

Her DSP adımı için tanımlanmalı
Kontrol stratejisi geliştirilmeli
Design space oluşturulmalı

Size Uygun Eğitimi Bulun

Bireysel mi yoksa kurumsal mı eğitim arıyorsunuz?

DSP Verim Hesaplama

Step Yield (Adım Verimi)

Step Yield (%) = (Çıkış miktarı / Giriş miktarı) × 100

Overall Yield (Toplam Verim)

Overall Yield = Step₁ × Step₂ × Step₃ × ... × Stepₙ

Örnek:

Protein A: 95%
Viral inaktivasyon: 98%
AEX: 90%
SEC: 95%
UF/DF: 95%

Toplam: 0.95 × 0.98 × 0.90 × 0.95 × 0.95 = 75.6%

Yaygın Zorluklar

Teknik Zorluklar

Zorluk	Çözüm Yaklaşımı
Düşük verim	Proses optimizasyonu, DoE
Agregasyon	pH, sıcaklık kontrolü, surfaktan
HCP temizliği	Ortogonal kromatografi adımları
Ölçeklendirme sorunları	Pilot çalışmalar, karakterizasyon