SDS-PAGE Nedir?

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis), proteinlerin molekül ağırlıklarına göre ayrıldığı elektroforetik tekniktir. Biyokimya ve moleküler biyoloji laboratuvarlarının temel tekniklerinden biridir.

Temel Prensip: SDS deterjanı proteinleri denatüre ederek negatif yük kazandırır. Elektrik alanında proteinler poliakrilamid jel içinden geçerken, küçük proteinler hızlı, büyük proteinler yavaş hareket eder.

SDS-PAGE Nasıl Çalışır?

Denatürasyon ve SDS Bağlanması

SDS bağlanması: ~1.4 g SDS / 1 g protein oranında bağlanır
Negatif yük: SDS sülfat grupları proteine uniform negatif yük verir
Denatürasyon: β-merkaptoetanol veya DTT disülfid bağlarını kırar
Lineer yapı: Proteinler açılarak lineer hale gelir

Sonuç: Tüm proteinler benzer yük/kütle oranına sahip olur, ayrım sadece boyuta bağlıdır.

Elektroforez Prensibi

(-) Katot ←—— Protein göçü ←—— (+) Anot
         Küçük = Hızlı
         Büyük = Yavaş

Poliakrilamid jel moleküler elek görevi görür; gözenek boyutuna göre proteinleri boyutlarına göre ayırır.

Jel Sistemi: Süreksiz (Discontinuous) PAGE

İki Jel Bölgesi

Bölge	Akrilamid	pH	Fonksiyon
Yığma Jeli (Stacking)	%4-5	6.8	Numuneleri konsantre eder
Ayırma Jeli (Resolving)	%8-15	8.8	Proteinleri boyuta göre ayırır

Ayırma Jeli Seçimi

Akrilamid %	Ayrılabilen MW Aralığı
%6	60-200 kDa
%8	40-150 kDa
%10	20-100 kDa
%12	15-70 kDa
%15	10-45 kDa

Gradient jel (%4-20): Geniş MW aralığı için idealdir.

Jel Hazırlama Protokolü

Ayırma Jeli (%10, 10 mL)

Bileşen	Miktar
dH₂O	4.0 mL
%30 Akrilamid/Bis	3.3 mL
1.5 M Tris-HCl pH 8.8	2.5 mL
%10 SDS	100 µL
%10 APS	100 µL
TEMED	10 µL

Yığma Jeli (%4, 5 mL)

Bileşen	Miktar
dH₂O	3.4 mL
%30 Akrilamid/Bis	0.83 mL
0.5 M Tris-HCl pH 6.8	0.63 mL
%10 SDS	50 µL
%10 APS	50 µL
TEMED	5 µL

Dikkat: APS ve TEMED en son eklenir (polimerizasyonu başlatır). TEMED nörotoksiktir, dikkatli çalışılmalıdır.

Numune Hazırlama

Laemmli Sample Buffer (2X)

Bileşen	Konsantrasyon	Fonksiyon
Tris-HCl pH 6.8	125 mM	pH tamponlama
SDS	%4	Denatürasyon
Gliserol	%20	Yoğunluk (kuyu dibine oturma)
β-merkaptoetanol	%10	Disülfid redüksiyonu
Bromofenol mavisi	%0.02	Boya frontu (takip)

Hazırlama Adımları

Numune + 2X buffer (1:1)
95°C'de 5 dakika ısıtma (veya 70°C 10 dk)
Kısa santrifüj (spin down)
Jele yükleme

Protein miktarı: Coomassie için 10-50 µg/kuyu, gümüş boyama için 0.1-1 µg/kuyu

Elektroforez Koşulları

Running Buffer (1X)

Tris: 25 mM
Glisin: 192 mM
SDS: %0.1
pH: ~8.3

Çalıştırma Parametreleri

Aşama	Voltaj	Süre
Yığma jeli	80-100 V	Boya frontu ayırma jeline gelene kadar
Ayırma jeli	120-150 V	Boya frontu jel sonuna yaklaşana kadar

Alternatif: Sabit akım (15-20 mA/jel) de kullanılabilir.

Toplam süre: ~1-2 saat (mini jel için)

Boyama Teknikleri

1. Coomassie Brilliant Blue

En yaygın yöntem

Adım	Solüsyon	Süre
Fiksasyon	%50 metanol, %10 asetik asit	30 dk
Boyama	%0.1 Coomassie R-250, %50 metanol, %10 asetik asit	1-2 saat
Renk açma	%50 metanol, %10 asetik asit	Arka plan temizlenene kadar

Hassasiyet: ~100 ng protein/bant Avantaj: Basit, ucuz, kantitatif

2. Gümüş Boyama (Silver Stain)

Yüksek hassasiyet için

Adım	Solüsyon	Süre
Fiksasyon	%50 metanol, %5 asetik asit	30 dk
Yıkama	%50 metanol	10 dk
Sensitizasyon	Na₂S₂O₃	1 dk
Gümüş	AgNO₃	20 dk
Geliştirme	Formaldehit + Na₂CO₃	Bantlar görünene kadar
Durdurma	%5 asetik asit	5 dk

Hassasiyet: ~1 ng protein/bant (Coomassie'den 100x daha hassas) Dezavantaj: Daha karmaşık, bazı proteinlerle uyumsuz

3. Floresan Boyalar

Boya	Hassasiyet	Avantaj
SYPRO Ruby	~1 ng	Geniş lineer aralık
SYPRO Orange	~4 ng	SDS jellerinde iyi
Flamingo	~1 ng	Hızlı protokol

Size Uygun Eğitimi Bulun

Bireysel mi yoksa kurumsal mı eğitim arıyorsunuz?

Molekül Ağırlığı Belirleme

Protein Markerleri

Bilinen MW'ye sahip protein karışımları (ladder/marker) kullanılır:

Yaygın Markerler	MW Aralığı
Prestained Marker	10-250 kDa
Unstained Marker	10-200 kDa
Low Range	6-66 kDa
High Range	40-300 kDa

MW Hesaplama

Rf değeri hesapla: Rf = (Protein göç mesafesi) / (Boya frontu göç mesafesi)
Standartlar için log(MW) vs Rf grafiği çiz
Bilinmeyen proteinin Rf değerinden MW'yi interpole et

Western Blot Transfer

SDS-PAGE sonrası proteinler membrana transfer edilebilir:

Transfer Türleri

Tür	Avantaj	Dezavantaj
Wet Transfer	Verimli, büyük proteinler	Uzun süre (1-2 saat)
Semi-dry	Hızlı (30-60 dk)	Küçük-orta proteinler
Dry Transfer	Çok hızlı (7 dk)	Özel ekipman, pahalı

Membran Türleri

Membran	Özellik	Kullanım
Nitroselüloz	Düşük arka plan	Standart uygulamalar
PVDF	Dayanıklı, yüksek bağlama	Küçük proteinler, sekans

Troubleshooting

Bulanık veya Dağınık Bantlar

Neden: Yüksek voltaj, ısınma
Çözüm: Voltajı düşür, soğutma kullan

Gülümseyen Bantlar (Smile Effect)

Neden: Eşit olmayan jel polimerizasyonu
Çözüm: APS/TEMED taze, homojen karıştırma

Zayıf Bant Yoğunluğu

Neden: Yetersiz protein, transfer kaybı
Çözüm: Protein miktarını artır, boyama süresini uzat

Yüksek Arka Plan

Neden: Yetersiz renk açma, kirli solüsyonlar
Çözüm: Renk açma süresini uzat, taze solüsyon kullan

SDS-PAGE Alternatifleri

Teknik	Amaç
Native PAGE	Aktif proteinler (SDS yok, denatürasyon yok)
2D Elektroforez	IEF + SDS-PAGE (proteomik)
Gradient PAGE	Geniş MW aralığı
Tris-Tricine PAGE	Küçük peptidler (<10 kDa)
SDS-Agarose	Çok büyük proteinler (>500 kDa)